Hvad er CRISPR?

CRISPR-teknologi er et enkelt, men alligevel kraftigt værktøj til redigering af genomer. Det gør det muligt for forskere let at ændre DNA-sekvenser og ændre genfunktionen. Dets mange potentielle anvendelser inkluderer korrigering af genetiske defekter, behandling og forhindring af spredning af sygdomme og forbedring af afgrøder. Dog løfter det også etiske bekymringer.

I populær brug er "CRISPR" (udtales "crisper") kortfattet for "CRISPR-Cas9." CRISPR'er er specialiserede DNA-strækninger. Proteinet Cas9 (eller "CRISPR-associeret") er et enzym, der fungerer som et par molekylære saks, der er i stand til at skære DNA-tråde.

CRISPR-teknologien blev tilpasset fra de naturlige forsvarsmekanismer for bakterier og archaea (domænet for encellede mikroorganismer). Disse organismer bruger CRISPR-afledt RNA og forskellige Cas-proteiner, inklusive Cas9, til at folieangreb fra vira og andre fremmedlegemer. De gør det primært ved at hugge op og ødelægge DNA'et fra en fremmed invaderer. Når disse komponenter overføres til andre, mere komplekse organismer, tillader det manipulation af gener, eller "redigering."

Indtil 2017 vidste ingen rigtig, hvordan denne proces så ud. I et papir, der blev offentliggjort 10. november 2017, i tidsskriftet Nature Communications, viste et team af forskere ledet af Mikihiro Shibata fra Kanazawa University og Hiroshi Nishimasu fra University of Tokyo, hvordan det ser ud, når en CRISPR er i aktion for det allerførste tid. [Et betagende nyt GIF viser CRISPR Tygge op DNA]

CRISPR-Cas9: De vigtigste spillere

CRISPRs: "CRISPR "står for" klynger af regelmæssigt mellemliggende korte palindromiske gentagelser. "Det er en specialiseret region af DNA med to forskellige karakteristika: tilstedeværelsen af ​​nukleotid gentagelser og afstandsholdere. Gentagne sekvenser af nukleotider - byggestenene til DNA - er fordelt over en CRISPR Afstandsholdere er bit af DNA, der er iscenesat blandt disse gentagne sekvenser.

I tilfælde af bakterier er afstandsstykkerne taget fra vira, der tidligere angreb organismen. De tjener som en bank af erindringer, der gør det muligt for bakterier at genkende viraerne og bekæmpe fremtidige angreb.

Dette blev først demonstreret eksperimentelt af Rodolphe Barrangou og et team af forskere hos Danisco, et fødevareingrediensfirma. I et papir fra 2007, der blev offentliggjort i tidsskriftet Science, brugte forskerne Streptococcus thermophilus bakterier, som ofte findes i yoghurt og andre mejerikulturer, som deres model. De observerede, at efter et virusangreb blev nye spacere inkorporeret i CRISPR-regionen. Desuden var DNA-sekvensen for disse afstandsholdere identisk med dele af virusgenomet. De manipulerede også afstandsstykkerne ved at tage dem ud eller indsætte nye virale DNA-sekvenser. På denne måde var de i stand til at ændre bakteriens modstand mod et angreb fra en bestemt virus. Forskerne bekræftede således, at CRISPR'er spiller en rolle i reguleringen af ​​bakterieimmunitet.

CRISPR RNA (crRNA): Når en spacer er inkorporeret og virussen angriber igen, transkriberes en del af CRISPR og behandles til CRISPR RNA eller "crRNA." Nukleotidsekvensen af ​​CRISPR fungerer som en skabelon til frembringelse af en komplementær sekvens af enkeltstrenget RNA. Hver crRNA består af en nukleotid-gentagelse og en afstandsdel, ifølge en anmeldelse fra 2014 af Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentier, offentliggjort i tidsskriftet Science.

Cas9: Cas9-proteinet er et enzym, der skærer fremmed DNA.

Proteinet binder typisk til to RNA-molekyler: crRNA og et andet kaldet tracrRNA (eller "transaktiverende crRNA"). De to leder derefter Cas9 til målsiden, hvor de vil få sit snit. Denne vidde af DNA er komplementær til en 20-nukleotidstrækning af crRNA.

Ved hjælp af to separate regioner, eller "domæner" på dens struktur, skærer Cas9 begge strenge af DNA-dobbelthelixen, hvilket gør det, der er kendt som en "dobbeltstrenget pause", ifølge Science-artikel 2014.

Der er en indbygget sikkerhedsmekanisme, der sikrer, at Cas9 ikke bare skærer et sted i et genom. Korte DNA-sekvenser kendt som PAM'er ("protospacer tilstødende motiver") tjener som tags og sidder ved siden af ​​mål-DNA-sekvensen. Hvis Cas9-komplekset ikke ser en PAM ved siden af ​​sin mål-DNA-sekvens, skærer den ikke. Dette er en mulig grund til, at Cas9 ikke nogensinde angriber CRISPR-regionen i bakterier, ifølge en anmeldelse fra 2014, der blev offentliggjort i Nature Biotechnology.

CRISPR-Cas9 som et redigeringsmiddel til genomer

Genomerne af forskellige organismer koder for en række meddelelser og instruktioner inden for deres DNA-sekvenser. Genomredigering involverer at ændre disse sekvenser og derved ændre meddelelserne. Dette kan gøres ved at indsætte et snit eller et brud i DNA'et og narre en celles naturlige DNA-reparationsmekanismer til at introducere de ændringer, man ønsker. CRISPR-Cas9 giver et middel til at gøre det.

I 2012 blev der offentliggjort to centrale forskningsartikler i tidsskrifterne Science og PNAS, som hjalp med at omdanne bakteriel CRISPR-Cas9 til et enkelt, programmerbart genomredigeringsværktøj.

Undersøgelserne udført af separate grupper konkluderede, at Cas9 kunne rettes til at skære en hvilken som helst DNA-region. Dette kunne gøres ved blot at ændre nukleotidsekvensen for crRNA, der binder til et komplementært DNA-mål. I Science-artiklen fra 2012 forenklede Martin Jinek og kolleger systemet yderligere ved at smelte crRNA og tracrRNA til at skabe et enkelt "guide RNA." Genomredigering kræver således kun to komponenter: en guide-RNA og Cas9-proteinet.

"Driftsmæssigt designer du en strækning på 20 [nukleotid] basepar, der matcher et gen, som du vil redigere," sagde George Church, professor i genetik ved Harvard Medical School. Et RNA-molekyle komplementært til disse 20 basepar er konstrueret. Kirke understregede vigtigheden af ​​at sikre, at nukleotidsekvensen kun findes i målgenet og ingen andre steder i genomet. "Så vil RNA plus proteinet [Cas9] - som et saks - skære DNA'et på det sted, og ideelt intet andet sted," forklarede han.

Når DNA'et er skåret, sparker cellens naturlige reparationsmekanismer ind og arbejder med at introducere mutationer eller andre ændringer i genomet. Der er to måder dette kan ske på. I henhold til Huntingtons Outreach-projekt ved Stanford (University) involverer en reparationsmetode limning af de to udskæringer sammen. Denne metode, kendt som "ikke-homolog slutforbindelse", har en tendens til at introducere fejl. Nukleotider indsættes eller udelades ved et uheld, hvilket resulterer i mutationer, der kan forstyrre et gen. I den anden metode fikses bruddet ved at udfylde spalten med en sekvens af nukleotider. For at gøre dette bruger cellen en kort streng DNA som en skabelon. Forskere kan levere den DNA-skabelon, de vælger, og derved indtaste det gen, de ønsker, eller korrigere en mutation.

Værktøj og begrænsninger

CRISPR-Cas9 er blevet populært i de senere år. Church bemærker, at teknologien er let at bruge og er omkring fire gange mere effektiv end det tidligere bedste genomredigeringsværktøj (kaldet TALENS).

I 2013 blev de første rapporter om brug af CRISPR-Cas9 til redigering af humane celler i en eksperimentel indstilling offentliggjort af forskere fra laboratorierne i Church og Feng Zhang fra Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology og Harvard. Undersøgelser med in vitro (laboratorium) og dyremodeller af menneskelig sygdom har vist, at teknologien kan være effektiv til at korrigere genetiske defekter. Eksempler på sådanne sygdomme inkluderer cystisk fibrose, grå stær og Fanconi-anæmi, ifølge en oversigtsartikel fra 2016, der blev offentliggjort i tidsskriftet Nature Biotechnology. Disse undersøgelser baner vejen for terapeutiske anvendelser hos mennesker.

"Jeg tror, ​​den offentlige opfattelse af CRISPR er meget fokuseret på ideen om at bruge genredigering klinisk til at helbrede sygdom," sagde Neville Sanjana fra New York Genome Center og en lektor i biologi, neurovidenskab og fysiologi ved New York University. "Dette er uden tvivl en spændende mulighed, men dette er kun et lille stykke."

CRISPR-teknologi er også blevet anvendt i fødevare- og landbrugsindustrien til at konstruere probiotiske kulturer og til at vaccinere industrielle kulturer (for eksempel yoghurt) mod vira. Det bruges også i afgrøder til at forbedre udbytte, tørke tolerance og ernæringsmæssige egenskaber.

En anden potentiel anvendelse er at skabe gendrev. Dette er genetiske systemer, der øger chancerne for, at en bestemt egenskab går videre fra forælder til afkom. Til sidst, i løbet af generationer, spreder egenskaben sig gennem hele populationer, ifølge Wyss Institute. Gendrev kan hjælpe med at kontrollere spredningen af ​​sygdomme, såsom malaria, ved at øge steriliteten blandt sygdomsvektoren - hunkøn Anopheles gambiae myg - ifølge artiklen Nature Biotechnology fra 2016. Derudover kunne gendrev også bruges til at udrydde invasive arter og vende modstand mod pesticider og herbicider, ifølge en artikel fra 2014 af Kenneth Oye og kolleger, der er offentliggjort i tidsskriftet Science.

CRISPR-Cas9 er dog ikke uden sine ulemper.

"Jeg tror, ​​at den største begrænsning af CRISPR er, at den ikke er hundrede procent effektiv," fortalte Church. Desuden kan effektiviteten af ​​genomredigering variere. I henhold til Science Science-artiklen fra 2014 af Doudna og Charpentier, skete genredigering i en undersøgelse udført i ris i næsten 50 procent af cellerne, der modtog Cas9-RNA-komplekset. Mens andre analyser har vist, at afhængig af målet, kan redigeringseffektiviteten nå op til 80 procent eller mere.

Der er også fænomenet "effekter uden for målet", hvor DNA skæres på andre steder end det tilsigtede mål. Dette kan føre til introduktion af utilsigtede mutationer. Desuden bemærkede Kirken, at selv når systemet skærer ned på målet, er der en chance for ikke at få en præcis redigering. Han kaldte dette "genom vandalisme."

Indstilling af grænser

De mange potentielle anvendelser af CRISPR-teknologi rejser spørgsmål om de etiske fordele og konsekvenser af at manipulere med genomer.

I Science-artiklen fra 2014 peger Oye og kolleger på den potentielle økologiske virkning ved at bruge gendrev. En introduceret egenskab kunne sprede sig ud over målpopulationen til andre organismer gennem krydsning. Gendrev kan også reducere målpopulationens genetiske mangfoldighed.

Foretagelse af genetiske modifikationer af menneskelige embryoner og reproduktionsceller, såsom sæd og æg, er kendt som kimlinedigering. Da ændringer af disse celler kan videregives til efterfølgende generationer, har brug af CRISPR-teknologi til at foretage kimlinieændringer rejst en række etiske bekymringer.

Variabel effekt, effekter uden for mål og upræcise redigeringer udgør alle sikkerhedsrisici. Derudover er der meget, der stadig er ukendt for det videnskabelige samfund. I en artikel fra 2015, der blev offentliggjort i Science, bemærker David Baltimore og en gruppe forskere, etikere og juridiske eksperter, at redigering af kimline rejser muligheden for utilsigtede konsekvenser for fremtidige generationer "fordi der er grænser for vores viden om human genetik, gen-miljøinteraktioner, og sygdomsveje (inklusive samspillet mellem en sygdom og andre tilstande eller sygdomme hos den samme patient). "

Andre etiske betænkeligheder er mere nuancerede. Bør vi foretage ændringer, der grundlæggende kan påvirke fremtidige generationer uden at have deres samtykke? Hvad nu hvis brugen af ​​redigering af kimelinjer adskiller sig fra at være et terapeutisk værktøj til et forbedringsværktøj til forskellige menneskelige egenskaber?

For at tackle disse bekymringer sammensatte National Academies of Sciences, Engineering and Medicine en omfattende rapport med retningslinjer og anbefalinger til genomredigering.

Selvom de nationale akademier opfordrer til forsigtighed i at forfølge redigering af kim, understreger de "forsigtighed betyder ikke forbud." De anbefaler at kun redigering af kimline udføres på gener, der fører til alvorlige sygdomme, og kun når der ikke er andre rimelige behandlingsalternativer. Blandt andre kriterier understreger de behovet for at have data om sundhedsrisici og fordele og behovet for kontinuerligt tilsyn under kliniske forsøg. De anbefaler også at følge op på familier i flere generationer.

Seneste forskning

Der har været mange nylige forskningsprojekter baseret på CRISPR. "Tempoet for grundlæggende forskningsopdagelser er eksploderet takket være CRISPR," sagde biokemiker og CRISPR-ekspert Sam Sternberg, gruppelederen for teknologiudvikling hos Berkeley, Californien-baserede Caribou Biosciences Inc., der udvikler CRISPR-baserede løsninger til medicin, landbrug og biologisk forskning.

Her er nogle af de seneste fund:

• I april 2017 frigav et team af forskere forskning i tidsskriftet Science om, at de havde programmeret et CRISPR-molekyle til at finde stammer af vira, såsom Zika, i blodserum, urin og spyt.
• Den 2. august 2017 afslørede forskere i tidsskriftet Nature, at de havde fjernet en hjertesygdomsdefekt i et embryo med succes ved hjælp af CRISPR.
• Den 2. januar 2018 meddelte forskere, at de muligvis kan stoppe svampe og andre problemer, der truer chokoladeproduktionen ved hjælp af CRISPR for at gøre planterne mere modstandsdygtige over for sygdomme.
• Den 16. april 2018 opgraderede forskere CRISPR til at redigere tusinder af gener på en gang, ifølge forskning udgivet af tidsskriftet BioNews.

Yderligere rapportering fra Alina Bradford, bidragyder.

Yderligere ressourcer

• Bredt institut: En tidslinje for det centrale arbejde med CRISPR
• Nyheder om genteknik og bioteknologi: CRISPR-Cas9 forbedret 10000 gange ved syntetiske nukleotider
• Bredt institut: Spørgsmål og svar om CRISPR